無菌藥品是關系國計民生的商品，《藥品生產質量管理規范》2010修訂版(Good manufacturing practice，GMP)于2011年3月1日起正式頒布實施，對無菌藥品生產過程控制提出了更為嚴格的要求，“應當限度的降低微生物、各種微粒和熱原的污染”，且“產品的無菌或其他質量特性絕不能只依賴于任何形式的終處理或成品檢驗(包括無菌檢查)”。因此，了解無菌藥品生產過程中的微生物負載情況，即微生物的種類和分布情況，建立無菌藥品生產過程中微生物污染溯源分析的有效方法具有極其重要的現實意義。
材料與方法
材料
培養基 
硫酸鹽液體培養基、改良馬丁液體培養基、胰酪胨大豆肉湯液體培養基、營養瓊脂培養皿、玫瑰紅鈉瓊脂培養皿、胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養皿、TSA(加中和劑)接觸碟， 來源于成都生物制品研究所有限責任公司培養基室。
陽性對照 
試驗菌株[CMCC(B)26003]金葡萄球菌。
儀器 
默克MAS100 NT浮游菌檢測儀，Millipore Microfil微生物限度儀，無菌檢查電腦集菌儀，B×41光學成像顯微鏡，VITEK2 Compact全自動微生物儀，電熱恒溫培養箱，生物安全柜。
主要試劑及耗材 
滅菌0.1%蛋白胨溶液、pH7.0無菌-蛋白胨緩沖液，自配；革蘭染色液，法國生物梅里埃公司；GN 卡、GP卡、BCL 卡、YST 卡，法國生物梅里埃公司。
方法
潔凈室環境及人員監測 
對乙型腦炎減毒活疫苗生產操作潔凈室進行浮游菌、沉降菌和設施設備及人員表面微生物動態檢測，C級(含局部層流) 每周一次，D級每月一次。表面微生物測試: 采用接觸碟法，即TSA(加中和劑)培養基充滿碟子并形成圓弧頂，取樣面積為 25 cm2，取樣時打開碟蓋，無菌培養基表面與取樣面直接接觸，均勻按壓接觸碟底板10s左右，確保培養基表面與取樣點表面均勻充分接觸，再蓋上碟蓋。然后將采樣后平皿先倒置于20～25℃恒溫培養箱(室)中培養3d進行菌落計數，再倒置于30～35℃恒溫培養箱(室)中培養2～3d進行菌落計數并判定結果。
微生物限度 
對乙型腦炎減毒活疫苗生產車間用水和純化水系統水點每周取樣一次，并使用 Millipore Microfil微生物限度儀進行檢測。
無菌檢查 
對2012年度生產的乙型腦炎減毒活疫苗所有批次中間產品使用薄膜過濾法進行無菌檢查。
菌型分析 
采用菌落形態特征觀察、革蘭染色鏡檢以及使用VITEK2 Compact全自動微生物儀對 2012 年度以上3項所獲的微生物進行分析。
結果
潔凈室環境及人員
2012年1月至12月潔凈區環境微生物檢測包括浮游菌、沉降菌、設施設備及人員表面微生物檢測，

醫藥無菌車間——潔凈板項目工程案例
項目名稱：濟南瑞康醫藥無菌車間
應用板材：潔凈板
應用系統：直接粘貼
施工時間：2017年6月
簡  介：濟南瑞康醫藥有限公司位于 臨港經濟開發區機場路東側，是瑞康醫藥股份全資子公司。無菌車間裝修項目使用墻冠UV氟碳潔凈板共計2000㎡。
潔凈板特性
1.防火
  潔凈板用特種硅酸鈣板作為基板，燃燒性能達到GB8624A1級標準要求。當室內發生火災時，能有效阻止火勢的蔓延，不會產生有毒煙霧，無火焰傳遞；
2.環保
  產品釋放量符合GB18580-2001E1級，生產過程不使用任何溶劑，可揮發性有機物（氡）＜200Bq/m3，無氨，無笨，放射性達到A類裝修材料標準。不含石棉；
3.
  潔凈板具有良好的性，抵抗多種病菌(大腸、金葡萄球菌、白色)在板材表面的存活；
4.耐腐蝕
  潔凈板具有相當的抵抗和二等各類腐蝕性物質的耐腐蝕性能，具有極強的耐酸、耐堿、的特性，包括各類清潔劑、消毒液及其它等；
5.耐候
  基板品越，涂層經過十一次紫外光固化工藝，板材耐候性能強，使用壽命長達25年以上。具有防輻射、抗靜電性能。

為便于對各凈化空氣調節系統、各醫藥潔凈室進行風量平衡和壓差調整，不同系統的排風應分開設置。
    由于散發粉塵和有害氣體區域的排風與一般排風的處置方式不同，同時又為了避免產生粉塵和有害氣體區域與一般區域相串通，故兩者的排風系統應分開設置。
1.2.12 本條為強制性條文。本條款規定是參照現行國家標準《工業建筑供暖通風與空氣調節設計規范》GB 50019制定的。
1.2.13 我國藥品GMP(2010年修訂)對于人員凈化用室的潔凈要求有了新的規定，本規范條了相應的修改：
    1 為保證人員凈化用室氣流由高潔凈級別流向低潔凈級別，當門處于正常關閉位置時，毗鄰更衣室之間需保持一定的壓力梯度。各更衣室之間大體可按以下原則確定其壓力梯度：靠近潔凈區氣鎖門兩側為5Pa；不同級別更衣室之間為10Pa；相同級別更衣室之間為5Pa；換鞋區與外走道之間為0Pa～5Pa。
    上述靠近潔凈區氣鎖門兩側壓差為5Pa，是由于考慮到氣鎖潔凈級別與毗鄰的潔凈室靜態級別相同，當氣鎖只有一扇門被打開時，不同級別更衣室之間仍可保持大于或等于10Pa的壓差。
    2 規定了人員凈化用室后段、前段各房間潔凈級別的原則。
    對于非無菌潔凈室，人員凈化用室前段為換鞋、更外衣，后段為更潔凈服；對于無菌潔凈室，前段為換鞋、更換外衣、更換無菌內衣，后段為更換無菌外衣。
    上述換鞋、更換外衣可設在有潔凈送風的清潔區。
    3 由于更衣室體積較小、更衣時動作幅度偏大、發塵量較大，所以更衣室的送風需要維持其級別足夠的送風量，使其盡快自凈。
    4 本條針對藥品人員凈化用室通道中正壓或負壓氣鎖，其氣鎖的設置應滿足下列要求：為阻斷生產區空氣外泄，在更衣進入通道中，穿潔凈外衣(無菌外衣)與潔凈生產區之間設正壓氣鎖、氣鎖壓力高于兩側房間；在退出通道中，設脫潔凈外衣為負壓氣鎖，空氣壓力低于兩側房間(兩側房間的潔凈級別不得低于負壓氣鎖)，以此阻斷潔凈生產區空氣通過人員凈化通道擴散。
    有關人員凈化更衣室的布置、潔凈級別劃分、房間壓力和氣流流向、壓差計設置，可以參照《藥品GMP指南——廠房設施與設備》“空調凈化系統”中的5．2．10凈化更衣。
    生產廠房的人員總更衣區不屬潔凈區，其中的換鞋、存外衣、盥洗、廁所、淋浴等房間會產生灰塵、臭氣和水汽，所以應設置通風措施。具體的做法可送入經過濾后的室外空氣，廁所、浴室單獨設置排風并使保持負壓。
1.2.15 根據我國藥品GMP(2010年修訂)附錄1“無菌藥品”中第三十八條的規定，醫藥潔凈室空氣凈化系統應保持連續運行，維持相應的潔凈級別和對周圍低級別區域的正壓，維持良好的氣流方向。因故停機再次開啟空氣凈化系統時，應當進行必要的驗證以確認其仍能達到規定的潔凈級別。
    在非生產時間，由于潔凈室內主要污染源(操作人員)的撤離，室內的發塵量大大降低，為了節省運行費用，在滿足潔凈級別和正壓的前提條件下，可以采用降低空氣凈化系統風量的方法。而降低多少風量，需由各生產廠根據運行實踐中的不同情況予以確定。
    圖4為某廠灌封間(B級潔凈區)從動態轉變為靜態恢復時間內室內微粒數的變化曲線圖(室內換氣次數為55次/h、操作人員6人)。當潔凈室由動態轉變為靜態時，室內微粒數迅速降低，若仍維持動態條件下的55次/h換氣次數，室內實測對于大于或等于0．5μm、大于或等于5．0μm的微粒的靜態限值仍有較大空間(如對大于或等于0．5μm，靜態實測為27顆／ft3，而B級的靜態限值相當于100顆／ft3)，可以認為在非生產狀態下減少送風量是完全可行的。

各種空氣潔凈度級別潔凈室的空氣凈化處理均應采用初效、中效、空氣過濾器過濾。對于A／B／C級潔凈室的末端過濾器效率應采用大于或等于99．95％(MPPS／H13)～大于或等于99．995％(MPPS／H14)。根據國際制藥工程協會(ISPE)基準指南-無菌藥品生產設施及國外相關文獻的描述，單向流系統內的HEPA過濾器效率應為99．99％(IEST／H13／DOP或PAO)，其完整性掃描檢漏通過率必須在99．99％以上；對于B級區至少采用效率應為99．97％的HEPA過濾器，但其完整性掃描檢漏通過率需在99．99％以上。
1.2.2 本條規定了凈化空氣調節系統中各級空氣過濾器設置的幾項原則。
    1 中效空氣過濾器宜集中設置在凈化空氣處理機組的正壓段，因為考慮到負壓段來自機組外空氣的滲漏，會造成未經中效空氣過濾器過濾的污染空氣進入系統，增加了空氣中的含塵濃度，加大下游空氣過濾器的過濾負擔，縮短其使用年限。
    2 凈化空氣調節系統的HEPA過濾器安裝位置通常布置在系統末端送風口處或集中設置于AHU末端。HEPA過濾器設置系統末端主要優點是可將送風受到再污染的危險降到，所以本條建議HEPA過濾器設置于凈化空氣調節系統末端。
    服務于無菌藥品的凈化空氣調節系統，根據國際制藥工程協會(ISPE)基準指南-無菌藥品生產設施的描述“所有無菌生產分級區A／B／C的送風均應經過濾器處理，由于系統中HEPA過濾器安裝的關鍵在于避免空氣再次受到污染，因此對于B級及以上的凈化級別，送風末端必須設置HEPA過濾器”，末端HEPA過濾器裝置對于保證無菌區域整體性來說是非常重要的。
    3 在回風、排風系統中，由于空氣中往往帶有粉塵等有害物質，為防止未經過濾處理的空氣泄漏，污染周圍環境，因此應將過濾器設置在回風、排風機的負壓吸入端，既起到保護環境的作用，又起到保護風機的作用。
    4 空氣過濾器的額定風量是在一定濾速下的風量，設計中為了降低凈化空氣調節系統的系統總阻力，在選擇空氣過濾器送風口時，一般按額定風量的70％～80％選用。
1.2.3 本條規定了醫藥潔凈室在劃分空氣調節系統應遵照的各項要求。
    1 凈化空氣調節系統不能與一般空氣調節系統合并，因為凈化空氣調節系統末端風口上裝有空氣過濾器，而一般空氣調節系統風口上無過濾器，空氣過濾器風口在運行過程中阻力會增加，而一般空氣調節系統的風口運行中的阻力不變，所以隨著運行時間的增加，可能出現醫藥潔凈室風量越來越小，并使醫藥潔凈室的房間或區域的空氣壓力發生變化。同時還考慮到醫藥潔凈室需要良好的密閉性，也不允許通過風道使醫藥潔凈室與一般空調房間連通。
    2 由于無菌生產區的潔凈度級別，微生物控制，溫度、濕度要求，消毒方式與消毒頻率等方面較非無菌生產區均有較大差別，所以從工藝操作要求、空調系統的運行管理、維護與節能方面而言，服務于兩個不同區域的凈化空氣調節系統應分開設置。
    3 含有可燃、易爆或有害物質的生產區(如原料藥生產中的提取、結晶等工序)所占面積較大時，從安全角度考慮，其空氣調節系統應與其他空氣調節系統分開。但在制劑生產中，遇有布置分散的小面積該類醫藥潔凈室，當系統上采用足夠的安全措施后，可合用一個空調送風系統。
    5 由于一個凈化空氣調節系統只有一個送風參數，對于溫度、濕度控制要求差別大的醫藥潔凈室，若合并使用同一個空氣調節系統，送風參數需要按照溫、濕度要求高的確定，才能同時滿足參數要求低的區域(除非在送風支管上另設二次空氣處理設備)，這樣會造成不必要的能量耗費，所以對溫度、濕度要求差別大的區域，宜設置不同的凈化空氣調節系統，以提供不同要求的送風參數。而有時系統區域較小，分開設置可能因空氣調節系統過多而增加造價，在經過技術經濟比較后也可合并設置。
    另外，別與低級別的醫藥潔凈室(如A／B級與C／D級)除了在潔凈級別，溫度、濕度要求不同外，分開設置將有利于醫藥潔凈室凈化空氣調節系統的運行管理。再者，系統風量大時，由于總送風回風管、機組體積均占用空間較大，且對機組強度性能、安裝及維護運行帶來不利因素，建議宜分開設置。
    其他因產品類別不同而需獨立設置的凈化空氣調節系統，見本標準第9．6．1條。
1.2.4 本條為強制性條文。本條第2款關于病原體操作區的回風利用問題，我國藥品GMP(2010年修訂)附錄3“生物制品”第二十二條規定：“……來自病原體操作區的空氣不得循環使用”。按照此條款的要求，凡是涉及病原體操作的生產區域，無論其危害程度屬于哪一類，均不能利用回風，由此造成凈化空氣調節系統能耗的增加，不利節能降耗的原則。
    根據《中華共和國藥典》(2015版Ⅲ部)“生物制品生產檢定用菌毒種管理規程”，生物制品生產檢定用菌毒種的危害程度，按照《人間的病原微生物名錄》為基礎，根據病原微生物的性、感染后對個體或者群體的危害程度，分為四類：
    類病原微生物：指能夠引起人類或動物非常嚴病的微生物，以及我國尚未發現或已經宣布消滅的微生物。
    第二類病原微生物：指能夠引起人類或動物嚴病，比較容易直接或間接在人與人、人與動物、動物與動物間傳播的微生物。
    第三類病原微生物：指能夠引起人類或動物疾病，但一般情況下對人、動物或環境不構成嚴重危害，傳播高風險有限，實驗室感染后很少引起嚴病，并且具備有效的和預防措施的微生物。
    第四類病原微生物：指在通常情況下不會引起人類或動物疾病的微生物。
    根據現行國家標準《實驗室生物安全通用要求》GB 19489和《生物安全實驗室建筑技術規范》GB 50346的有關規定，實驗室生物安全防護等級(BSL，biosafety level)按所操作的生物因子的危害程度分為，其中一級防護程度，防護程度。以此類推，一類病原體操作的生物安全防護等級為BSL-4，二類病原體操作的生物安全防護等級為BSL-3，三類病原體操作的生物安全防護等級為BSL-2，四類病原體操作的生物安全防護的等級為BSL-1。
    根據“生物制品生產檢定用菌毒種管理規程”及其附錄可知，生物制品生產檢定用的菌毒種，均屬于第二類、第三類、第四類病原體，其相對應的生物安全防護等級分別為BSL-3、BSL-2、BSL-1。
    根據現行國家標準《實驗室 生物安全通用要求》GB 19489-2008第6．3．3．3條的要求：“(BSL-3實驗室)不得使用實驗室防護區排出的空氣”(BSL-4實驗室按照BSL-3執行)。而對于BSL-1、BSL-2實驗室，則無此要求。
    根據世界衛生組織(WHO)2004年頒布的實驗室生物安全手冊(Laboratory Biosafety Manual，Third Edition，2004)，關于生物安全等級的要求見表7。